衆所周知，晚期胃癌和(hé)結直腸癌會引發嚴重的(de)腹腔積液，并常常導緻惡性腹水（MA）的(de)出現。在臨床上對于惡性腹水的(de)主要治療方法是針對惡性腫瘤細胞的(de)治療，例如(rú)化療和(hé)靶向治療。雖然當前治療手段在不斷的(de)進步，但是仍然存在各種缺點和(hé)限制。首先，治療不能完全停止腹水的(de)産生，因為(wèi)腹水是由腹膜血管的(de)生成和(hé)血管滲透性介導增強産生的(de)，主要是由腫瘤細胞對藥物的(de)原發性和(hé)繼發性抗性引起的(de)。第二，狀況不佳的(de)患者，尤其是老年(nián)患者，既不适合化療也不适合手術，而隻能接受姑息性容量以減輕壓迫症狀，包括通過穿刺引流腹水，也就是腹膜分流術。然而這種方法往往會導緻蛋白質流失，電解質紊亂，甚至危及生命的(de)感染。
OH2病毒是一(yī)種ICP34.5和(hé)ICP47基因缺失，并表達人GM-CSF的(de)單純溶瘤疱疹病毒。ICP47基因的(de)缺失導緻US11基因處于ICP47早期啓動子(zǐ)的(de)控制之下，而不是處于導緻腫瘤選擇性複制增強的(de)US11晚期啓動子(zǐ)的(de)控制。ICP34.5編碼序列替換為(wèi)由巨噬細胞啓動子(zǐ)、編碼人類GM-CSF的(de)基因和(hé)牛生長(cháng)激素pA序列組成的(de)序列盒。
1.OH2在體外和(hé)體內(nèi)的(de)溶瘤能力
在文中作者構建了CT26小鼠腫瘤模型，分别向腫瘤內(nèi)注射3種不同劑量的(de)OH2(1E6、1E5、1E4CCID50)，觀測OH2在體內(nèi)從第一(yī)次給藥到第21天後抑制腫瘤生長(cháng)的(de)情況。(A)治療方案的(de)模式；(B,C)E4組第21天的(de)腫瘤體積和(hé)生長(cháng)曲線；(D,E)E5組第21天的(de)腫瘤體積和(hé)生長(cháng)曲線；(F,G)E6組第21天的(de)腫瘤體積和(hé)生長(cháng)曲線。以上結果表明OH2能夠有效地(dì)抑制腫瘤的(de)生長(cháng)，其中E6和(hé)E5可(kě)能是腹水研究的(de)合适劑量。
2.OH2抑制小鼠腹水生成
OH2抑制腹水生成，延長(cháng)存活時間。(A)治療方案的(de)模式；(B)在第一(yī)次治療後的(de)第9天，OH2抑制了小鼠腹水重量中的(de)腹水生成；(C)不同組中總存活時間的(de)曲線。
3. 腹水中OH2感染後的(de)細胞因子(zǐ)水平
(A)自(zì)第一(yī)次治療後第4天腹水的(de)細胞因子(zǐ)水平；(B)自(zì)第一(yī)次治療後第9天腹水的(de)細胞因子(zǐ)水平；(C)自(zì)第一(yī)次治療後第4天血清中的(de)細胞因子(zǐ)水平；(D)第一(yī)次治療後第9天血清中的(de)細胞因子(zǐ)水平。
作者發現，OH2組小鼠在接受治療後第4天，檢測後發現其腹水中多種細胞因子(zǐ)水平（尤其是IL-6和(hé)IFN-γ）比對照組高(gāo)（超過四倍）,TNF和(hé)IFN-γ的(de)水平也呈上升趨勢（圖3）。在實驗結束時（第9天），仍有腹水的(de)小鼠體內(nèi)的(de)細胞因子(zǐ)雖然略高(gāo)于對照組，但是與之前相比顯著下降。小鼠外周血細胞因子(zǐ)水平與腹水相比基本正常。結果表明，OH2可(kě)能是通過其直接的(de)溶瘤細胞毒性作用促進炎症的(de)發生從而導緻細胞死亡，其特征是促炎細胞因子(zǐ)（主要是IL-6）的(de)快速大量分泌。因此，是否存在區域細胞因子(zǐ)風暴以及如(rú)何激活免疫系統并協同發揮抗腫瘤作用是作者進一(yī)步研究的(de)目的(de)。
4. OH2激活腹水中的(de)CD8+T和(hé)CD4+T細胞
通過流式細胞儀分析，在第4天和(hé)第9天，OH2增加了小鼠腹水中CD4+和(hé)CD8+T細胞的(de)數量。(A)對照組腹水中CD8+和(hé)CD4+T細胞；(B)OH2治療腹水中的(de)CD8+和(hé)CD4+T細胞；(C)第4天小鼠腹水中CD4+和(hé)CD8+T細胞的(de)百分比；(D)第9天小鼠腹水中CD4+和(hé)CD8+T細胞的(de)百分比，結果表明OH2可(kě)以促進各種淋巴細胞的(de)增殖從而改變腹水的(de)免疫微環境。
5. 通過scRNA-seq進行的(de)T細胞亞群和(hé)功能分析
作者将T細胞分成不同的(de)免疫群體組(圖5)，通過對每個群體的(de)标記基因表達進行scRNA測序。作者發現在這六組細胞中(圖5C)，T細胞、單核細胞、巨噬細胞、B細胞、NK細胞和(hé)中性粒細胞的(de)比例随着OH2感染而急劇變化。
對上調的(de)T細胞中進一(yī)步分析顯示，CD4+和(hé)CD8+T細胞數量都顯著增加，其中CD4+的(de)影響更強(圖5E，F)。大量中性粒細胞的(de)激活可(kě)能與細胞因子(zǐ)的(de)釋放有關，是導緻局部細胞因子(zǐ)風暴的(de)原因之一(yī)。
此外，注射OH2以後，NK細胞的(de)比例随着IFN-γ的(de)上調而輕度增加，IFN-γ是一(yī)種代表免疫刺激活性的(de)細胞因子(zǐ)（圖5C）。值得注意的(de)是，免疫抑制性Treg細胞在OH2處理(lǐ)的(de)腹水中也富集，這表明OH2對免疫微環境的(de)調節不是直接的(de)陰陽二元效應，而是交互影響。
同時，免疫抑制相關基因的(de)表達水平随着T細胞比例的(de)增加而升高(gāo)。例如(rú)，作者在T細胞和(hé)嗜中性粒細胞的(de)OH2治療組中發現免疫檢查點基因的(de)上調，如(rú)Cd274(編碼PD-L1)和(hé)Pdcd1(編碼PD1)(圖5F，H)。
6. 通過tocilizumab阻斷IL-6信号通路下調OH2活性以消退腹水
通過tocilizumab(托珠單抗，IL-6受體抑制劑)阻斷IL-6信号通路從而下調OH2活性。作者通過同步托珠單抗暴露在模型動物中顯著消除了由OH2引起的(de)延遲腹水生長(cháng)的(de)效果（圖6），并且未能延長(cháng)存活期，這與具有未受損IL-6信号傳導的(de)小鼠模型不同。
然而，當IL-6信号傳導在病毒給藥96小時後受到托珠單抗藥理(lǐ)抑制作用時，腹水阻塞的(de)OH2效應無法抵消，最終啓動了有效的(de)抗癌免疫。作者分析了六種細胞因子(zǐ)的(de)水平，發現IL-6失活也可(kě)能導緻TNF-α的(de)強烈下調和(hé)IFN-γ的(de)釋放。值得注意的(de)是，OH2在IL-6信号傳導抑制後也不足以增加CD4+T細胞和(hé)CD8+T細胞的(de)數量，這再次表明炎症風暴是免疫激活的(de)主要原因。
7. 結果與讨論
OH2能夠通過腹膜內(nèi)注射消除腹水并顯著延長(cháng)攜帶CT26腫瘤細胞的(de)小鼠的(de)存活，即使局部細胞因子(zǐ)風暴也不會對主要器官造成明顯的(de)全身性損傷。與用5-氟尿嘧啶或無應答者治療的(de)小鼠相比，在用OH2治療的(de)腹水小鼠中觀察到促炎細胞因子(zǐ)(主要是IL-6)的(de)高(gāo)分泌，以及CD4+和(hé)CD8+T細胞浸潤的(de)增加。此外，IL-6途徑的(de)初始階段阻斷能夠顯著抑制由OH2驅動的(de)抗腫瘤免疫反應。
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