近期研究表明溶瘤病毒（OV）正在成為(wèi)免疫原性細胞死亡（ICD）的(de)有效誘導劑，其在感染癌細胞後可(kě)激活固有免疫細胞，引起固有免疫應答，釋放出有效抗癌免疫的(de)內(nèi)源性分子(zǐ)（DAMP），誘導有效的(de)抗癌免疫。溶瘤新城疫病毒（NDV）在膠質瘤細胞和(hé)肺癌細胞中均能産生ICD。ICD的(de)特征是損傷相關分子(zǐ)模式（DAMP）、OV衍生病原體相關分子(zǐ)模式（PAMP）分子(zǐ)和(hé)炎性細胞因子(zǐ)的(de)分泌、釋放或表面暴露。
在已完成第一(yī)期/第二期臨床試驗的(de)OVs中，新城疫病毒（NDV）是一(yī)種禽副粘病毒，作為(wèi)晚期癌症患者的(de)溶瘤劑，已取得不錯療效，此外，溶瘤NDV通過誘導ICD在原位膠質瘤中觸發腫瘤特異性免疫記憶。來自(zì)上海的(de)邵曉燕團隊最近報告了一(yī)株溶瘤NDV菌株FMW（此處為(wèi)NDV/FMW）是肺癌細胞中有效的(de)ICD誘導劑。在本研究中，研究人員的(de)目的(de)是探讨NDV／FMW是否誘導黑色素瘤細胞ICD及其調控途徑。作者發現，NDV/FMW在培養的(de)黑色素瘤細胞和(hé)小鼠模型中都能觸發ICD，且可(kě)以通過靶向信号轉導子(zǐ)和(hé)轉錄激活子(zǐ)3（STAT3）來調節。
為(wèi)了探讨NDV／FMW是否能在黑色素瘤細胞中引發ICD，該研究團隊首先檢測NDV／FMW是否能在黑色素瘤細胞中複制并引發胞死亡。與作者之前在肺癌和(hé)甲狀腺癌細胞中的(de)研究結果一(yī)緻，NDV /FMW在人類黑色素瘤A375和(hé)C8161細胞中能大量複制，表現為(wèi)病毒滴度升高(gāo)和(hé)NDV血凝素神經氨酸酶蛋白（HN）的(de)表達上調。鑒于溶瘤NDV在膠質瘤和(hé)肺癌細胞中觸發ICD，該團隊假設NDV /FMW會在黑色素瘤細胞中誘導ICD。為(wèi)了驗證這一(yī)假設，該團隊測量了病毒感染後上清液中的(de)ICD标記物ATP、HMGB1和(hé)HSP70/90的(de)含量，并檢查了受感染黑色素瘤細胞的(de)細胞表面CRT表達（外CRT）。選擇米托蒽醌（MTX）治療作為(wèi)陽性對照，如(rú)圖1A所示，與模拟感染細胞相比，NDV/FMW感染的(de)A375和(hé)C8161細胞的(de)共焦成像顯示，在感染後24和(hé)48（hpi），細胞表面CRT（紅(hóng)色）的(de)暴露增加。
正如(rú)預期的(de)那樣，MTX治療在兩種黑色素瘤細胞系中都誘導了CRT的(de)強烈暴露。此外，流式細胞術分析進一(yī)步證實了NDV/FMW感染誘導的(de)A375和(hé)C8161細胞CRT暴露（圖1B）。為(wèi)了檢測NDV感染的(de)黑色素瘤細胞中的(de)分泌性DAMP，收集細胞培養基并在24和(hé)48 hpi下濃縮。ELISA法檢測ATP分泌和(hé)HMGB1釋放，免疫印迹法檢測其他釋放的(de)DAMP。如(rú)圖1C、E所示，經ELISA測定，在24小時或48小時感染A375和(hé)C8161細胞系的(de)NDV/FMW分别導緻細胞外ATP和(hé)HMGB1的(de)增加。此外，在48 hpi時，在感染NDV/FMW的(de)A375和(hé)C8161細胞系的(de)濃縮上清液中檢測到HMGB1和(hé)HSP70/90蛋白水平顯著升高(gāo)（圖1D）。
ICD的(de)發生率通常被認為(wèi)與細胞凋亡、自(zì)噬、程序性壞死或內(nèi)質網應激密切相關。作者之前的(de)研究表明，自(zì)噬而非凋亡或壞死有助于NDV介導誘導的(de)肺癌細胞ICD。在黑色素瘤細胞中檢測細胞凋亡、自(zì)噬、壞死或內(nèi)質網應激可(kě)能在NDV/FMW觸發的(de)ICD中發揮作用，研究人員分别用泛半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑Z-VAD-FMK（Z-VAD）、自(zì)噬抑制劑氯喹（CQ）、壞死抑制劑Necrostain-1（Nec1）和(hé)內(nèi)質網應激抑制劑GSK2606414（GSK）預處理(lǐ)細胞。圖2A顯示，與單獨使用病毒處理(lǐ)的(de)細胞相比，受試的(de)四種抑制劑均有效減緩了暴露于NDV/FMW的(de)A375細胞中HMGB1和(hé)HSP70/90的(de)釋放。在C8161細胞中獲得了與A375細胞相似的(de)結果（圖2C）。此外，為(wèi)了評估凋亡、自(zì)噬、壞死或內(nèi)質網應激抑制劑對新城疫病毒/FMW誘導的(de)細胞死亡的(de)影響，圖2B、D顯示了台盼藍試驗的(de)細胞死亡率（圖2B、D）。
JAK-STAT3信号在抗癌免疫治療和(hé)白細胞介素-6（IL-6）介導的(de)腫瘤進展效應等細胞因子(zǐ)中起着關鍵作用。因此，該團隊假設STAT3可(kě)能在黑色素瘤細胞中NDV誘導的(de)ICD中發揮作用。為(wèi)了驗證這一(yī)點，該團隊首先檢測了黑色素瘤細胞中STAT3（Y705處STAT3的(de)酪氨酸磷酸化）對NDV/FMW感染的(de)反應。如(rú)圖3A所示，NDV/FMW感染A375和(hé)C8161細胞導緻48 hpi時pSTAT3（Y705）顯著下降。Mcl-1和(hé)Bcl-xl是兩個已知的(de)STAT3靶基因，在感染細胞中持續下調（圖3A）。接下來，該團隊研究了抑制STAT3對黑色素瘤細胞中NDV／FMW複制和(hé)細胞死亡的(de)影響。
為(wèi)了實現這一(yī)目标，該團隊在實驗中使用了C188-9，這是一(yī)種在晚期癌症早期臨床試驗（NCT03195699）中評估過的(de)特異性STAT3抑制劑，并驗證了其療效通過降低(dī)STAT3的(de)磷酸化水平。作者觀察到，在48 hpi下，用C188-9預處理(lǐ)明顯拮抗NDV/FMW感染誘導的(de)A375和(hé)C8161細胞PARP裂解、p62減少和(hé)eIF2α磷酸化（圖3B）。值得注意的(de)是，C188-9治療降低(dī)了感染黑色素瘤細胞中NDV蛋白HN的(de)蛋白水平（圖3B），表明抑制STAT3可(kě)能會減少黑色素瘤細胞中NDV/FMW的(de)複制。
在證明STAT3的(de)藥理(lǐ)學(xué)抑制會影響NDV/FMW介導的(de)黑色素瘤細胞死亡後，作者提出抑制STAT3是否會對NDV/FMW誘導的(de)ICD标記物産生影響。如(rú)圖4A、B所示，分别通過共聚焦成像和(hé)流式細胞術測定，用C188-9預處理(lǐ)減少了A375和(hé)C8161細胞中NDV/FMW感染引起的(de)CRT暴露。此外，通過免疫印迹和(hé)ELISA檢測，暴露于C188-9可(kě)減少NDV感染後A375和(hé)C8161細胞中HMGB1、HSP70和(hé)HSP90的(de)ATP分泌和(hé)釋放（圖4C-E）。有趣的(de)是，IL-6預處理(lǐ)增強了NDV/FMW處理(lǐ)的(de)A375細胞和(hé)C8161細胞中HSP90的(de)釋放（圖4C）。此外，與單獨的(de)病毒感染相比，C188-9治療降低(dī)了NDV/FMW感染細胞的(de)病毒産量，而IL-6處理(lǐ)提高(gāo)了A375細胞和(hé)C8161細胞的(de)病毒滴度（圖4F）。
為(wèi)了排除C188-9可(kě)能的(de)脫靶效應，研究人員用慢病毒介導的(de)靶向STAT3的(de)shRNA在A375和(hé)C8161細胞中穩定地(dì)敲除STAT3。通過免疫印迹試驗證實了敲除的(de)結果（圖5A）。這與C188-9對NDV/FMW介導的(de)黑色素瘤細胞死亡的(de)影響一(yī)緻，STAT3缺失也降低(dī)了NDV/FMW誘導的(de)PARP裂解和(hé)eIF2α磷酸化（圖5B）。值得注意的(de)是，與對照shRNA處理(lǐ)的(de)A375細胞相比，STAT3缺失的(de)A375細胞中ICD标記物的(de)誘導（包括CRT暴露、ATP分泌、HMGB1以及NDV感染時HSP70/90的(de)釋放）嚴重減弱（圖5C-F）。這在C8161細胞中獲得了類似的(de)結果（圖5C–F）。
該團隊之前的(de)研究表明，NDV感染的(de)肺癌細胞上清液在體內(nèi)抑制腫瘤生長(cháng)。為(wèi)了研究NDV感染的(de)黑色素瘤細胞上清液是否能抑制體內(nèi)黑色素瘤的(de)生長(cháng)，研究人員收集并濃縮了上清液并用紫外線照射以滅活病毒。A375腫瘤模型小鼠瘤內(nèi)注射NDV /FMW，或濃縮上清液或空白對照。如(rú)圖6A所示，與空白對照的(de)腫瘤相比，上清液顯著抑制了黑色素瘤的(de)生長(cháng)。正如(rú)預期的(de)那樣，NDV/FMW注射顯著降低(dī)了腫瘤生長(cháng)（圖6A）。此外，與瘤內(nèi)注射PBS的(de)小鼠相比，瘤內(nèi)注射濃縮上清液明顯延長(cháng)了A375腫瘤模型小鼠的(de)存活時間（圖6B）。
該團隊的(de)研究表明并證明，溶瘤NDV \ FMV病毒能刺激黑色素瘤細胞中ICD印記的(de)表達和(hé)釋放。除此之外，該團隊還驗證了細胞死亡的(de)多樣性，這在很大程度上進一(yī)步促進了NDV/FMV誘導的(de)ICD标記物的(de)釋放。值得注意的(de)是，轉錄因子(zǐ)STAT3在暴露于NDV /FMW的(de)黑色素瘤細胞中誘導ICD中起着關鍵作用。
文章(zhāng)來源：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2019.00436/full